合成寡核苷酸——包括反義寡核苷酸(ASOs)、siRNA、適配體及DNA/RNA探針等——是通過與mRNA結(jié)合來阻斷翻譯過程并抑制不必要的蛋白質(zhì)合成的短鏈、單鏈DNA/RNA分子的。這類寡核苷酸通過固相亞磷酰胺合成法合成，在合成過程中，5'-羥基需用酸敏感型5'-二甲氧基三苯甲基（DMT）基團(tuán)保護(hù)。DMT既能避免在鏈延伸過程中發(fā)生副反應(yīng)，又可在合成后保留以輔助純化。但最終產(chǎn)物中必須去除DMT。

DMT在結(jié)構(gòu)上具有強(qiáng)疏水性，這使其能夠通過疏水相互作用層析法（HIC）進(jìn)行純化。由于傳統(tǒng)的RPC技術(shù)分離需要大量使用有機(jī)溶劑，由此引發(fā)安全性、成本和環(huán)境問題備受關(guān)注。HIC填料可在水溶液體系進(jìn)行分離，具備替代RPC分離的潛力。

基于此，東曹生命科學(xué)推出了高載量型HIC填料TSKgel Phenyl-3PW(20)，能夠一步高效分離DMT-on/off寡核苷酸及柱上DMT基團(tuán)的剪切，實(shí)現(xiàn)低成本、高效率的寡核苷酸純化工藝。

TSKgel Phenyl-3PW（20）產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：

TSKgel Phenyl-3PW(20) 是一款專為寡核苷酸、多肽等中分子量樣品純化而開發(fā)的疏水填料，表1展示了此款填料的性能參數(shù)。

表1. TSKgel Phenyl-3PW（20）基本參數(shù)

新款填料通過優(yōu)化孔徑和增強(qiáng)疏水性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)寡核苷酸的高吸附載量。圖1展示了在硫酸銨、檸檬酸鹽條件下，TSKgel Phenyl-3PW(20)的吸附載量比公司原有HIC填料提升了2.5倍以上。

圖1. 對(duì)20-mer DMT-on寡核苷酸的靜態(tài)吸附載量

TSKgel Phenyl-3PW（20）的分離選擇性：

圖2展示了4種不同配基的TOYOPEARL疏水填料，在分離DMT-on/off寡核苷酸時(shí)表現(xiàn)出的不同分離選擇性?？梢钥闯?，TSKgel Phenyl-3PW(20)在4款填料中的吸附力zui強(qiáng)。

圖2. 四款HIC填料分離DMT-on/off寡核苷酸的對(duì)比

DMT-on/off寡核苷酸的分離效果：

圖3展示的是使用TSKgel Phenyl-3PW(20)分離20-mer的DMT-on寡核苷酸，收集到的組分再使用離子交換色譜柱TSKgel DNA-STAT和RPC色譜柱對(duì)其進(jìn)行分析。DMT-on/off寡核苷酸可以很好地分開，且RPC-HPLC的檢測結(jié)果顯示回收率可達(dá)99%。

圖3. DMT-on/off寡核苷酸的分離

一步柱上純化和DMT剪切的方法：

圖4展示的是使用TSKgel Phenyl-3PW(20)在酸性條件下進(jìn)行在線剪切DMT保護(hù)基團(tuán)，剪切后洗脫出來的DMT-off立即使用1 M Tris（pH 9.0）進(jìn)行中和。然后用TSKgel DNA-STAT色譜柱分析，結(jié)果顯示DMT-off寡核苷酸目標(biāo)物的回收率為94%，RPC分析結(jié)果顯示未檢測到DMT-on寡核苷酸。

圖4. 在線剪切純化DMT-off寡核苷酸

總結(jié)：

合成寡核苷酸的純化及DMT剪切對(duì)基因治療應(yīng)用至關(guān)重要，而傳統(tǒng)工藝中DMT的剪切與去除需要分步進(jìn)行，這會(huì)增加工藝時(shí)間和復(fù)雜度。東曹新推出的TSKgel Phenyl-3PW（20）疏水填料，在pH4.0條件下能夠高效一步純化及柱上DMT剪切，既保持了寡核苷酸的完整性，簡化工藝流程，又可實(shí)現(xiàn)寡核苷酸的大規(guī)模純化。

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